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Apr 13, 2023

Evidencia estructural de intermediarios durante la formación de O2 en el fotosistema II

Naturaleza volumen 617, páginas

Nature, volumen 617, páginas 629–636 (2023)Citar este artículo

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En la fotosíntesis natural, la división del agua impulsada por la luz en electrones, protones y oxígeno molecular constituye el primer paso del proceso de conversión de energía solar en energía química. La reacción tiene lugar en el fotosistema II, donde el grupo Mn4CaO5 primero almacena cuatro equivalentes oxidantes, los estados intermedios S0 a S4 en el ciclo de Kok, generados secuencialmente por separaciones de carga fotoquímica en el centro de reacción y luego cataliza la química de formación de enlaces O–O1, 2,3. Aquí, informamos instantáneas de temperatura ambiente mediante cristalografía de rayos X de femtosegundos en serie para proporcionar información estructural sobre el paso de reacción final del ciclo de oxidación del agua fotosintética de Kok, la transición S3→[S4]→S0 donde se forma O2 y se reinicia el reloj de oxidación del agua de Kok . Nuestros datos revelan una secuencia compleja de eventos, que ocurren en micro a milisegundos, que comprenden cambios en el grupo Mn4CaO5, sus ligandos y vías de agua, así como la liberación controlada de protones a través de la red de enlaces de hidrógeno del canal Cl1. Es importante destacar que el átomo de O adicional Ox, que se introdujo como ligando puente entre Ca y Mn1 durante la transición S2→S34,5,6, desaparece o se reubica en paralelo con la reducción de Yz a partir de aproximadamente 700 μs después del tercer destello. El inicio de la evolución de O2, como lo indica el acortamiento de la distancia Mn1-Mn4, ocurre alrededor de 1200 μs, lo que significa la presencia de un intermedio reducido, posiblemente un peróxido unido.

La cristalografía de rayos X de femtosegundos en serie en láseres de electrones libres de rayos X (XFEL)7 nos permitió recopilar datos de cristalografía del fotosistema II (PS II) en tiempo real a medida que avanza la reacción a temperatura fisiológica. La reacción de oxidación del agua inducida por cuatro fotones en PS II (Fig. 1a, b) se inició con múltiples destellos láser visibles. Usando esta capacidad, se han estudiado estructuras de estado S intermedio (S0, S1, S2 y S3)4,5,8,9,10 que revelaron los cambios estructurales del complejo de evolución de oxígeno (OEC) de PS II, que es un funcional unidad compuesta por el grupo Mn4CaO5 y su entorno agua-ligando (Fig. 1c, d) 2,11. Recientemente, recopilamos datos instantáneos en varios momentos durante la transición S2→S3, el paso en el que se introduce un sustrato de agua en el grupo. El estudio6 sugirió la secuencia de oxidación de Mn, la incorporación de un puente de oxígeno adicional (Ox u O6 en Suga et al.10) entre el sitio de coordinación abierto en Mn1 y Ca (formando Mn4CaO5-Ox en S3), la ruta de entrada potencial para el sustrato el agua y la liberación de protones con su mecanismo de activación6,12. Los estudios XFEL también establecieron claramente que la estructura electrónica y geométrica de la OEC obtenida por estas mediciones no se ve afectada por los fotoelectrones de rayos X en las condiciones utilizadas6,8,13.

a, La estructura del PS II con las hélices incrustadas en la membrana y las regiones extrínsecas de la membrana en el lado de la luz del PS II mostradas en gris. Los principales componentes de transferencia de electrones se muestran en color, que incluyen las clorofilas del centro de reacción (P680), las feofitinas, los aceptores de quinonas QA y QB, la tirosina Yz con actividad redox y el grupo catalítico Mn4CaO5. El grupo Yz y Mn4CaO5 son los cofactores del sitio donador de electrones. b, Ciclo de Kok de la reacción de oxidación del agua que tiene lugar en el sitio donante y que es impulsada secuencialmente por separaciones de carga en el centro de reacción P680 inducidas por la absorción de fotones (destellos de luz de nanosegundos, 1F–4F) en el sistema de antena de PS II. Los datos de cristalografía de rayos X a temperatura ambiente se recopilaron en los puntos de tiempo indicados durante la transición S3→S0. c,d, La estructura del OEC en los estados S3 (c) y S0 (d) y la secuencia de eventos que ocurren entre ellos. manganeso, violeta; Ca2+, verde; Oh, rojo. W1, -2, -3 y -4 son ligandos de agua de Mn4 y Ca. Los canales relevantes para la transferencia de agua y protones (O1, O4 y Cl1) se indican como áreas sombreadas en rojo, azul y verde, respectivamente. Los círculos punteados marcan diferencias estructurales entre los estados S3 y S0.

En el estudio actual, investigamos el paso de evolución del oxígeno del ciclo de oxidación del agua de Kok (Fig. 1b), la transición S3→[S4]→S0 (Fig. 1c,d). En muestras de PS II adaptadas a la oscuridad, esta transición se inicia con el tercer destello láser visible. El OEC se oxida en este paso desde el estado S3 totalmente de Mn(IV) al estado S4 altamente reactivo propuesto con estados de oxidación formales de Mn(IV)4O⦁ o Mn(IV)3(V). Esto inicia la formación de enlaces O-O y la liberación de O2, y el sitio de unión ahora vacante se llena con un nuevo sustrato de agua que forma el estado de oxidación más bajo del grupo (S0). Este proceso de varios pasos, que también implica la liberación de dos protones, tiene la constante de tiempo más larga entre las transiciones de estado S y su cinética depende de la especie y la preparación de la muestra14,15,16,17,18,19.

Para proporcionar información estructural sobre este paso de reacción complejo y, específicamente, la importante interacción entre el grupo Mn4CaO5 y su entorno de proteína y agua (Fig. 1c, d), recopilamos datos de cristalografía a temperatura ambiente de PS II en siete puntos de tiempo diferentes durante el S3 →Transición S0, con un rango de 50 μs a 4 ms después de iniciar esta transición (Fig. 1b). Todos los conjuntos de datos tienen resoluciones entre 2,00 y 2,16 Å (Tablas de datos ampliados 1 y 2).

El estado S3 se pobló mediante la iluminación de microcristales de PS II adaptados a la oscuridad con dos destellos láser de nanosegundos visibles in situ (2F en la Fig. 1b)4, en los que el intervalo entre destellos fue de 200 ms para tener en cuenta la cinética QA y QB de la quinona aceptora y impulsar de manera eficiente las transiciones de estado S. Los puntos de tiempo entre los estados S3 y S0 se generaron dando el tercer flash láser de bomba visible en varios tiempos de retraso (Δt) antes de que los cristales se expusieran al pulso XFEL de femtosegundos (las etiquetas de tiempo en la Fig. 1b). Si bien nuestro protocolo de iluminación logra las poblaciones más altas posibles de estados S particulares, hay una mayor mezcla de poblaciones de estados S con un número creciente de destellos debido a ineficiencias intrínsecas específicas de PS II ("errores") (Métodos)20. Modelamos esta distribución en un modelo multicomponente durante el refinamiento estructural, siendo el componente 'primario' los centros que avanzan del estado S3 al S0. Los componentes 'secundario' y 'terciario' son los puntos iniciales y finales conocidos: por ejemplo, la población S3 decreciente y en tiempos de retraso más prolongados, la población S0 creciente de los centros que han completado la transición (Métodos y datos extendidos Tabla 3 tienen detalles ). Observamos que el componente primario en cada momento puede consistir en una mezcla de múltiples estructuras, que son intermedias entre S3 y S0. Todos los resultados discutidos a continuación corresponden a estos componentes primarios refinados del monómero I (cadenas anotadas en mayúsculas en las estructuras depositadas).

La Figura 2 muestra la densidad del mapa de omisión de los átomos seleccionados en el OEC y sus alrededores de la población refinada en los puntos de tiempo (Δt = 250, 500, 730, 1200 y 2000 μs) después del tercer flash (usamos la nomenclatura de 3F( Δt μs)). Para visualizar la secuencia de eventos durante la transición S3→[S4]→S0, seguimos los cambios en tres áreas: Yz y D1-H190 (Fig. 2a,b) y Ox y O5 (Fig. 2c), así como los ligandos de agua W1–W4 (Fig. 2d) y dos ligandos de carboxilato del grupo Mn4CaO5/Mn4CaO5-Ox que sirven de puente entre Mn y Ca (Fig. 2e). Además, los cambios de distancia atómica seleccionados se muestran en la Fig. 3, incluidos los datos de puntos de tiempo anteriores (50 μs) y posteriores (4000 μs).

a, Residuos D1-Y161 (Yz) y D1-H190. El mapa de omisión de la referencia de estado S3 se muestra en marrón claro para compararlo con los datos del punto de tiempo (azul). b, Una representación simplificada de los cambios estructurales observados en la región Yz. c, Omita la densidad de los átomos O5 y Ox del OEC. d, Omita la densidad de los átomos O5 y los ligandos de agua terminales W1, W2, W3 y W4 del OEC. e, Omita la densidad de los átomos de oxígeno del carboxilato de D1-E189 y D1-D170. Todos los mapas de omisión que se muestran en a y c–e se generaron omitiendo el átomo o residuo de interés individualmente, y solo se utilizó el componente primario (es decir, el estado que avanza a S0). Las características notables se resaltan con flechas rojas y un círculo negro discontinuo. Todos los mapas de omisión que se muestran están contorneados en 2.5σ, 3σ y 4σ usando el esquema de color anotado en d para facilitar la visualización. Consulte también el vídeo de información complementaria 1.

Todas las distancias se toman del componente refinado de cada punto de tiempo (es decir, el estado que avanza al estado S0). Las barras de error se calculan a partir del enfoque final/rápido descrito en Métodos y son un límite superior. Los datos aquí se muestran como valores medios ± desviación estándar. Las barras de error para cada punto de tiempo se obtuvieron de n = 100 refinamientos END/RAPID independientes. Se pueden encontrar más detalles sobre el procedimiento END/RAPID en Métodos. Las flechas discontinuas en los esquemas de la OEC a la derecha indican la ubicación de las distancias individuales. Mn se muestra como esferas moradas y O se muestra como esferas rojas.

La distancia entre Yz y D1-H190 se ha establecido previamente para que sea un indicador del estado de oxidación de Yz6. En el estado reducido, un fuerte enlace de hidrógeno entre Yz y D1-H190 da lugar a una distancia corta de unos 2,6 Å. Tras la oxidación de Yz por P680+, el protón fenólico de Yz se transfiere a D1-H190, la distancia aumenta a 2,8 Å y se observa un movimiento del plano del anillo de His (Fig. 2b). Nuestros datos muestran que la distancia ya aumenta entre los datos S3 y el primer punto de tiempo (50 μs), lo que indica que Yz está completamente oxidado en este momento (Fig. 3). A partir de entonces, esta distancia se mantiene constante hasta los 500 μs y vuelve al nivel base entre 730 y 1200 μs. Por lo tanto, los datos demuestran que la reducción de \({{\rm{Y}}}_{{\rm{z}}}^{\mathrm{ox}}\) por el grupo Mn4CaO5-Ox comienza solo después de alrededor de 500 μs (Tabla de datos ampliada 4)16,21,22 y parece estar completo en el punto de tiempo de 1200 μs. Se observan cambios de distancia adicionales entre Yz e His190 a 2000 y 4000 μs, lo que puede deberse a la reorganización de la red de enlaces de hidrógeno relacionada con la última liberación de protones, pero actualmente no se comprenden bien. Curiosamente, un cambio en la posición de un residuo de Tyr junto al par especial Chl tras la excitación de la luz se observó previamente en los datos de cristalografía de resolución temporal del centro de reacción bacteriano púrpura y se interpretó como originado por un cambio en las interacciones de enlace de hidrógeno de este Tyr tras la desprotonación23.

El oxígeno adicional Ox, presente en el estado S3, se pierde con la formación de S0, lo que indica que Ox puede participar en la formación del enlace O–O, y los cambios en su densidad probablemente informan sobre el inicio de este proceso. Para rastrear la población de Ox, Ox se eliminó del modelo OEC, y su densidad de mapa omitido se muestra en la Fig. 2c. O5 se omitió por separado, lo que permitió la comparación de sus densidades (ver también Datos extendidos Fig. 1). La densidad de omisión de Ox se vuelve asimétrica a partir de los 250 μs, con una clara reducción de la intensidad a partir de los 500 μs y cayendo al nivel de ruido entre los 1.200 y los 2.000 μs, y Ox solo puede modelarse con una población inferior al 20 % en los 2.000 μs punto de tiempo. Los cambios de intensidad de Ox ocurren concomitantemente con la reducción de \({{\rm{Y}}}_{{\rm{z}}}^{\mathrm{ox}}\), lo que indica que la formación de enlaces O–O ocurre entre 500 y 1200 μs. Durante toda la transición S3→[S4]→S0, la densidad de O5 permanece aproximadamente constante, excepto por una disminución de su densidad electrónica a 1200 μs.

Los marcadores adicionales para la presencia de Ox en el grupo son las distancias Mn-Mn. Como se informó anteriormente, la distancia Mn1–Mn4 aumenta durante la transición S2→S3 debido a la inserción de Ox (ref. 6). La Figura 3 muestra que la distancia Mn1–Mn4 permanece alargada en las estructuras 3F hasta 1200 μs (Métodos tiene un análisis más detallado) y luego disminuye durante los siguientes 3 ms para alcanzar el mismo valor que se observa en los estados S1 y S2. También se observa una tendencia similar en la distancia Mn1-Mn3. Por lo tanto, hay un retraso entre el inicio de la formación del enlace O–O (500–730 μs según los cambios observados para Yz y Ox) y el momento en que las distancias Mn–Mn comienzan a disminuir (1200 μs). El hallazgo indica que durante este período, es probable que exista un intermediario de oxidación del agua antes de la liberación de O2.

Se observan cambios en la forma y las intensidades para la densidad del mapa de omisión de los ligandos de agua W1–W4, que se muestran en la Fig. 2d. En concreto, se observa un ligero alargamiento de la densidad de O5 hacia W2 y un ligero alargamiento de la densidad de W4 hacia W3 a los 250 μs. Esta última tendencia continúa y, a los 500 μs, se observa una superposición de las densidades W3 y W4, con un pico mFobs − DFcalc (Fobs y Fcalc son los factores de estructura experimental y modelo respectivamente, mientras que m y D son factores de ponderación) en 2,5 σ entre W3 y W4 (Datos extendidos Fig. 2). Al mismo tiempo, la densidad de W1 se extiende hacia D1-D61 y W19, lo que indica una mayor movilidad de W1. Especulamos que todos estos movimientos están relacionados con la desprotonación del OEC y la transferencia de protones hacia el canal Cl1 (ver la siguiente sección y la Fig. 4).

a, El término del canal O1 cerca del OEC que incluye el grupo de cinco aguas (W26–W30) en esta región. Superpuesto está el mapa de densidad de electrones 2mFobs − DFcalc contorneado en 0.8σ, 1.0σ y 1.5σ. b, Los canales O4 y Cl1 (rama A) que incluyen la región D1-D61 y D1-E65/D2-E312 que se sugiere que funcione como una puerta de protones. Superpuestos están mFobs − DFcalc omite mapas para W1, W2 y D61 mostrados en 2.5σ, 3.0σ y 4.0σ. También se muestra el mapa de densidad de diferencia de Fobs (punto de tiempo) − Fobs (2F) dentro de un radio de 1,5 Å de W19/W20/W48 en el canal O4 en 3σ (mapa naranja). El ángulo de rotación observado en la cadena lateral de E65 en puntos de tiempo particulares se calcula con respecto a la posición de la cadena lateral correspondiente en el estado 2F. Los cambios principales se resaltan con una flecha o un círculo discontinuo. Todas las aguas están coloreadas por sus factores B de acuerdo con el esquema de color divergente que se muestra en la figura. Las interacciones importantes de los enlaces de hidrógeno se muestran con un esquema de color binario para indicar la fuerza (la distancia < 2,8 Å es roja y 2,8–3,2 Å es gris).

A los 730 μs, las densidades de O5, W2 y W3 se vuelven anisotrópicas, todas apuntando hacia una región entre estos tres átomos de oxígeno (Fig. 2d), lo que indica una mayor movilidad de estos ligandos. Al mismo tiempo, la densidad de Ox también es altamente anisótropa. Este movimiento de los cuatro átomos de oxígeno probablemente esté relacionado con la formación del intermedio de oxidación del agua. Notamos que el modelado preciso de la posición de Ox requerirá datos de mayor resolución. A 1200 μs, las densidades de todos los ligandos de agua terminales (W1–W4) y el puente O5 se vuelven más débiles. Una comparación de estas densidades del mapa de omisión dentro del OEC con la del átomo de O2, que se cree que no juega un papel destacado en el paso S3→S0, muestra que la reducción de la densidad es específica de estos cinco átomos (W1–W4 y O5) y Ox (datos extendidos Fig. 1). La superposición de las densidades O5, W2 y W3 ya no se observa a 1200 μs.

A los 2000 μs después del tercer destello, la densidad del mapa de omisión O5 se restablece considerablemente en comparación con los estados S3 y S0, pero las densidades del mapa de omisión de las aguas W1–W4 aún no han alcanzado un nivel similar y permanecen alargadas. Notamos una superposición similar de W1/W2 como se observa a 500 μs. Esto podría indicar el inicio de la segunda liberación de protones, que se sabe que ocurre en la transición S3→S0, después de la unión de agua que vuelve a llenar el sitio vacante formado por la liberación de O221,24,25. Curiosamente, la forma alargada de la densidad W3 persiste incluso en el estado S0, que modelamos previamente con dos posibles posiciones de W3 (ref. 4).

La Figura 2e muestra que los ligandos D1-D170 y D1-E189, que hacen de puente entre Mn y Ca, cambian su conformación durante la formación y liberación de O2. De acuerdo con la alta movilidad observada para los ligandos de agua W1 y W2, la conexión entre D1-D170 y Ca parece debilitarse entre 730 y 2000 μs y solo se restablece por completo en el estado S0 (3F (200 ms)).

De 1200 a 4000 μs, ocurren varios cambios estructurales, que se invierten con la formación del estado S0 estable (3F (200 ms)). Estos incluyen el aumento de las distancias Yz–D1-H190, Ca–D1-E189 y Mn4–O5, así como una disminución de las distancias Mn1–Mn4 y Mn1–Mn3. La mayoría de estos cambios son indicativos de la liberación de O2 y/o la inserción de agua a través del ion Ca26,27, posiblemente desde el canal O1 (ver más abajo). Esto indica que la liberación de O2 y la recarga del cúmulo con agua a granel y el restablecimiento del centro catalítico ocurren durante un período de tiempo prolongado.

El PS II tiene varios canales hidrofílicos que se extienden desde el OEC hasta el lado luminal de la membrana tilacoide11,28,29,30,31, y se propone que algunos de estos juegan un papel fundamental en el transporte de protones y aguas de sustrato durante el ciclo catalítico ( Los canales O1, O4 y Cl1 se muestran en la Fig. 1)24,32,33. En nuestro estudio reciente de la transición S2→S312, asignamos el canal O1, que se extiende desde O1 y Ca del OEC hasta la masa, como un canal de agua de sustrato y el canal Cl1, que se extiende desde W1 y W2 del OEC al grueso, para ser un canal de liberación de protones durante la transición S2→S36. La transición S3→S0 también implica la inserción de un sustrato de agua en el OEC y la liberación de dos protones a la mayor parte; se ha sugerido que un protón se libera antes de la formación del enlace O-O y el otro después de la unión de una molécula de agua al OEC24,25,34.

La Figura 4 muestra los datos de puntos de tiempo para los canales O1 y Cl1/O4 cerca del OEC durante la transición S3→S0. La densidad electrónica de las moléculas de agua en el canal O1 en la vecindad del OEC cambia sustancialmente como se muestra en los mapas 2mFobs − DFcalc (Fig. 4a), similar a lo que se observó durante la transición S2→S36. Las aguas W27, W28 y W32 (la Tabla complementaria 1 tiene numeración de agua) tienen una densidad de electrones baja y factores B altos (alrededor de 50 Å2) (Datos extendidos Fig. 3) en relación con las aguas más estables, como W29 (factor B de aproximadamente 37 Å2), en particular a 1.200 μs. Interpretamos esto como una indicación de la alta movilidad de estas aguas y planteamos la hipótesis de que esta región podría servir como entrada para el agua de sustrato que rellena el OEC después de la liberación de oxígeno molecular12. Por lo tanto, proponemos que PS II utilice el canal O1 para la entrada de sustrato en las transiciones S2→S3 y S3→S0. Entre el grupo de cinco aguas (W26-30) ("rueda hidráulica" en la referencia 6), W26 muestra una alta densidad de electrones a lo largo de la transición, con una densidad sustancialmente elevada a 500 μs. Como W26 está dentro de la distancia de enlace de hidrógeno con O1 del OEC, esta interacción puede ser importante para equilibrar la carga en el cúmulo, cuando el OEC avanza a través del último paso de oxidación (es decir, la formación del estado S4) y la subsiguiente formación de cuatro electrones. reducción para formar el estado S0.

También se observan cambios en el canal Cl1. A los 250 μs, el residuo D1-E65 gira 19° hacia W40, lo que acorta la distancia entre D1-E65 y W40 en 0,3 Å (Fig. 4b). Este es el punto de tiempo cuando la densidad de Ox comienza a volverse asimétrica, que es aún más pronunciada a los 500 μs (Fig. 2c). A 500 μs, la densidad del mapa de omisión de W1 también se alarga hacia la región de D1-D61 y W19 (Fig. 4b). Esto coincide con una disminución de la densidad de oxígeno del carboxilato D1-D61 que está dentro de la distancia del enlace de hidrógeno de W40 y un acortamiento de la distancia entre W40 y D1-E65 en 0,5 Å debido a la rotación (25°) de la cadena lateral. En consecuencia, se forma una red continua de enlaces de hidrógeno que conecta el OEC con la región D1-E65/D2-E312. Especulamos que los cambios están relacionados con la primera transferencia de protones desde el OEC hacia el canal Cl1. Estos cambios se invierten en el punto de tiempo de 730 μs (Fig. 4b). Otros estudios que utilizan diferentes métodos también han sugerido un evento de desprotonación temprana, con constantes de tiempo que oscilan entre 50 y 300 μs (es decir, antes del último evento de oxidación; la formación del estado transitorio S4)15,16,17,21,24 ,34,35.

A los 1200 μs, el residuo D1-E65 gira hacia W40 por segunda vez durante esta transición, acompañado de un acortamiento de la distancia W42-D1-E65 en 0,4 Å. Por lo tanto, una red de enlaces de hidrógeno desde el OEC hasta la región D1-E65/D2-E312, similar a lo que observamos a los 500 μs, se reforma en este momento. La distancia D1-E65/D2-E312 se alarga de aproximadamente 2,6 a aproximadamente 3,2 Å, lo que apunta a un debilitamiento sustancial de la interacción, formando probablemente una configuración que puede aceptar el próximo protón. Este cambio coincide con el momento en que la densidad de electrones Ox disminuye por debajo del nivel de detección en el mapa de omisión (Fig. 2), y las densidades W28, W27 y W32 disminuyen en el canal O1 (Fig. 4a). Interpretamos que esta serie de cambios está relacionada con el inicio del proceso de recuperación del grupo Mn4CaO5 (es decir, iniciado por la inserción de agua en el OEC junto con una desprotonación). A 2000 y 4000 μs, la cadena lateral de D1-E65 gira casi 40° desde su posición en la estructura S3 hacia W119 (Fig. 4b). La distancia D1-E65–W119 es de alrededor de 2,5 Å, lo que sugiere un protón compartido o una interacción muy estrecha entre estos dos grupos. D1-R334 también se mueve 20°, formando una interacción de enlace de hidrógeno con W41.

Los cambios alrededor de la región D1-E65/D2-E312 son indicativos de la liberación de protones a granel, ya que recuerdan lo que observamos para la liberación de protones durante la transición S2→S312. En la transición S3→S0, planteamos la hipótesis de que los primeros cambios de esta región (250–730 μs) están relacionados con la primera transferencia de protones y que los cambios posteriores (1200–4000 μs) están relacionados con la segunda transferencia de protones del OEC al grueso, a través de D1-D6136,37 a través de la rotación de D1-E65. Por lo tanto, el resultado actual sugiere que la región D1-E65/D2-E312 funciona como una puerta para la liberación de protones dos veces durante la transición S3→S0.

W20, que forma una estrecha red de enlaces de hidrógeno con O4 a través de W19 en el canal O4, desaparece durante la transición S1→S2 y reaparece en el estado S04. Su regreso durante la transición S3→S0 es, por lo tanto, un indicador de la recuperación total del estado S0. La primera indicación clara del retorno de W20 se encuentra en el mapa de diferencia Fobs (4000 μs) - Fobs (2F) (densidad naranja en la Fig. 4b), y se modeló con una ocupación del 40 % en el componente refinado de 4000 μs. Esto implica que la restauración de W20 ocurre en la etapa posterior de la recuperación de OEC.

Las instantáneas de las estructuras de PS II durante la transición S3→S0 muestran la secuencia y la progresión de cada uno de los eventos en múltiples ubicaciones con diferentes constantes de tiempo. Los cambios estructurales se pueden agrupar en términos generales en cuatro secciones con diferentes tiempos de inicio y cinética, como se muestra en la Fig. 5; son los cambios de estado redox de Yz, la primera desprotonación, la oxidación de OEC y la formación de O2 y la completa recuperación y puesta a cero del reloj de Kok en el estado S0.

La secuencia de eventos (i–iv) que conducen al primer evento de desprotonación, la liberación de oxígeno molecular, la inserción de agua y el segundo evento de desprotonación. Los átomos de OEC se muestran en púrpura (Mn), verde (Ca) y rojo (O). El canal O1 se muestra en rojo, el canal O4 en azul y el canal Cl1 en verde. Los ligandos de la OEC y los residuos que forman los canales de protones de agua están coloreados según la subunidad a la que pertenecen (D1, azul; D2, verde). Se muestran posibles vías para la transferencia de protones (flecha cian), agua (flecha roja discontinua), oxígeno (flecha roja continua) y electrones (flecha verde). Las características notables están resaltadas con flechas negras. El cuadro marrón derecho muestra los modelos sugeridos (modelo a y modelo b) para la formación de enlaces O–O. El oxígeno resaltado en magenta indica los átomos candidatos para la formación de O–O.

En el estado S3, los cuatro Mn están formalmente en el estado de oxidación (+IV). Observamos que la oxidación del ligando en lugar de Mn (formación de oxilo o un enlace oxo-oxilo) durante la transición S2→S3 ha sido sugerida en la literatura5, pero esto no está en línea con la espectroscopia de emisión de rayos X a temperatura ambiente (XES ) datos, que muestran la oxidación de Mn6,13. En el tercer destello, la oxidación de Yz ocurre por la donación de un electrón a P680+ después de la separación de carga en las clorofilas del centro de reacción. Se observa un aumento de la distancia entre Yz y D1-H190 en comparación con el estado S3 en 3F(50 μs) (Figs. 3 y 5(i)). Este cambio se asigna a la formación \({{\rm{Y}}}_{{\rm{z}}}^{\mathrm{ox}}\), que se sabe que ocurre dentro de los 30 μs después de la fotoexcitación38, y la translocación de protones relacionada entre \({{\rm{Y}}}_{{\rm{z}}}^{\mathrm{ox}}\) y D1-H190.

La formación \({{\rm{Y}}}_{{\rm{z}}}^{\mathrm{ox}}\) desencadena el primer evento de desprotonación probablemente durante el período de tiempo de 200–500 μs15,16 ,17,24,34,39. Observamos el comienzo de la rotación de D1-E65, que se propone que sea parte de la puerta de protones, y la formación de la vía del enlace de hidrógeno desde el OEC a esta región a los 250 μs. Junto con estos cambios, las densidades de electrones en W1 y D61 se vuelven más prominentes a 500 μs (Figs. 2d y 4b), potencialmente relacionadas con una liberación de protones del OEC a los residuos de la puerta de protones D1-E65 y D2-E312 (Fig. 5(ii)).

En la primera etapa del período de 500 a 1200 μs, se produce el último evento de oxidación (formación transitoria del estado S4, con Mn(IV)4O⦁ o Mn(IV)3(V)) y, posteriormente, la reducción de Mn tiene lugar (Fig. 5(iii)). La formación del enlace O-O debe desencadenarse por este evento de oxidación final de la OEC al estado S4 potencialmente de corta duración. El cambio en la distancia que observamos para Yz–D1-H190 entre 500 y 730 μs sugiere que la reducción de \({{\rm{Y}}}_{{\rm{z}}}^{\mathrm{ox} }\) tiene lugar durante este tiempo, a través de la transferencia de electrones desde el OEC a Yz. Después de la formación transitoria de S4, la reducción de cuatro electrones puede proceder en un paso con la formación del enlace O–O y la liberación inmediata de O2 o en dos pasos con la presencia de un intermediario antes de la liberación de oxígeno molecular del OEC. En el último caso, una especie de peroxo formada por una reducción inicial de dos electrones aparece muy probablemente como un intermediario.

Nuestros datos muestran que hay un retraso entre el inicio de la formación del enlace O–O (500–730 μs) como lo indica la distancia/rotación Yz–D1-H190 y la disminución de la densidad de electrones Ox y el inicio de la liberación de O2 apoyado por la contracción de distancia Mn1-Mn4 (1200 μs). Este tiempo de inicio para la liberación de O2 también está en línea con los estudios de evolución de O222,40. El retraso indica que existe un estado intermedio, posiblemente una especie similar al peróxido, que apunta hacia el mecanismo de reducción de electrones de dos pasos.

En la literatura se han propuesto varios sitios de formación de enlaces O–O basados ​​en estudios teóricos (Fig. 5)3,41,42,43,44,45,46,47,48,49. Entre estos, O5-Ox explica mejor nuestros datos debido a su proximidad y la ocupación reducida de O5 alrededor de 1200 μs (Fig. 5, modelo a). Sin embargo, en este momento no se pueden excluir otras dos posibilidades en las que O5 reacciona con W2 o W3 y Ox reemplaza a O5 (Fig. 5, modelo b). Si bien no se pueden descartar otros mecanismos que no involucren a O5, no hay evidencia clara que los respalde en los datos actuales.

A los 1200 μs, la densidad del mapa de omisión de Ox está por debajo del umbral de 2,5 σ, lo que indica que una fracción predominante de Ox se ha desplazado de su posición original en el grupo. La contracción de las distancias Mn1-Mn4 y Mn1-Mn3 a partir de este momento sugiere que el inicio de la liberación de O2 ocurre alrededor de este momento. Una vez que se libera O2, el relleno del grupo con un nuevo sustrato de agua parece ocurrir de inmediato. Esto se basa en la observación de que no falta densidad de oxígeno además de Ox, aunque las densidades del mapa omitido de todas las aguas terminales (W1–W4) y el puente O5 se debilitan a 1200 μs. Los datos respaldan que la liberación de O2 y la recarga del sitio están altamente coordinadas y probablemente ocurren a través de un agua terminal ya ligada a la OEC.

Tanto a 2000 como a 4000 μs (Fig. 5(iv)), la densidad Ox está dentro del nivel de ruido, lo que implica que Mn1 se vuelve predominantemente de cinco coordenadas. Mn4 tiene seis coordenadas, aunque la interacción Mn4–O5 es débil (2,2–2,3 Å), lo que sugiere que O5 puede ser un hidróxido. La distancia Ca-D1-E189 es aún más alargada en estos puntos de tiempo que en el estado S0. Se observan otras recuperaciones lentas en la región Yz (Fig. 2b), la 'rueda hidráulica' (Fig. 4a) y las regiones de puerta de protones (D1-E65/D2-E312) (Fig. 4b). Presumimos que un agua de la región de la 'rueda hidráulica' en el canal O1, similar a la transición S2→S36,12, reemplaza el ligando de agua terminal del OEC. Los cambios en la región de la puerta de protones podrían indicar la desprotonación del agua recién insertada36. Al mismo tiempo, el entorno de coordinación de aminoácidos, la red de enlaces de hidrógeno alrededor de la OEC y las aguas en los canales se restablecen al estado S0. Esto incluye la recuperación de W20 en el canal O4, que se propone que participe en la liberación de protones durante la transición S0→S14,50.

En el estudio actual, las instantáneas a temperatura ambiente de las estructuras del PS II hasta el paso final del reloj de Kok (S3→[S4]→S0) revelan detalles de los procesos moleculares para la oxidación fotosintética del agua. Hasta ahora, estos procesos se interpretaban en gran medida en base a estudios cinéticos. Es importante destacar que los resultados informados aquí brindan apoyo experimental para un mecanismo de reducción de dos pasos del grupo Mn4CaO5-Ox tras la formación del enlace O–O y la liberación de O2 con un intermedio transitorio, muy probablemente un peróxido unido. Este es un gran paso hacia la comprensión de la química de la reacción de oxidación del agua. Los resultados también muestran cómo los catalizadores biológicos, como el OEC en PS II, permiten reacciones multielectrónicas/multiprotónicas a través de la interacción entre el centro metálico, el entorno proteico y la red de agua. El papel activo del microambiente en las enzimas naturales brinda inspiración sobre cómo controlar tales reacciones en sistemas fotosintéticos artificiales que se pueden crear a partir de elementos abundantes en la tierra.

Las mediciones de difracción de rayos X de cristales de 20 a 60 µm preparados a partir de dímeros PS II de Thermosynechococcus vestitus (anteriormente denominado Thermosyncechococcus elongatus) se realizaron en ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico 100 mM, pH 6,5, cloruro de amonio 100 mM y 35% (peso/vol) PEG 5000 (refs. 51, 52). La suspensión de cristales de PS II, con una concentración de clorofila (Chl) de aproximadamente 0,5 a 1,2 mM, se cargó en una jeringa (jeringa hermética a gases Hamilton, 1 ml) y se adaptó a la oscuridad durante 1 h antes de la recopilación de datos. Se utilizó espectroscopia de masas de entrada de membrana (MIMS) para determinar la evolución de O2, los parámetros de recambio y las poblaciones en estado S4,6. Los cristales de PS II no mostraron contaminación por Mn (II) según XES y mediciones de resonancia paramagnética de electrones53 y exhibieron una actividad de 2500 ± 100 μmol O2 (mg(Chl) × h)−1.

La eyección acústica de gotas54 se utilizó en combinación con el método de entrega de muestras Drop-on-Tape55. Para capturar los intermedios estables S2, S3 y S0, cada gota de la suspensión de cristal se iluminó con pulsos láser de 120 ns a 527 nm usando un láser Nd:YLF (fluoruro de litio itrio) (Evolution, Coherent) en Linac Coherent Light Source ( LCLS) o por pulsos de láser de 8 ns a 532 nm usando una combinación de dos láseres Nd:YAG (granate de itrio y aluminio) (Minilite, Continuum) en Spring-8 Angstrom Compact free electron Laser (SACLA) a través de tres salidas acopladas de fibra con un tiempo de retraso de 200 ms entre cada iluminación y de 200 ms entre la última iluminación y la sonda de rayos X, similar al que se usó anteriormente para acomodar la cinética QA y QB de la quinona aceptora e impulsar de manera eficiente las transiciones del estado S4,6,55 . Implementamos un sistema de control de retroalimentación de la velocidad de la correa y el retraso de la deposición, y el retraso intermitente y la fase de la gota se ajustaron en consecuencia55. Para conseguir retardos de tiempo inferiores a 200 ms entre la iluminación y la sonda de rayos X, se utilizó un cuarto láser de "espacio libre". Se trataba de un láser Opolette 355 LD (Opotek, longitud de onda de 530 nm, ancho de pulso de 7 ns) en el instrumento LCLS/cristalografía macromolecular de femtosegundos o un sistema láser NT230 OPO (longitud de onda de 530 nm, ancho de pulso de 5 ns, EKSPLA Co .) en SACLA. Este láser de espacio libre se disparó para sincronizarse con el pulso de rayos X con un retraso ajustable que se estableció entre 50 y 4000 μs para este estudio. El láser se guió con óptica hasta el punto de interacción de rayos X y su posición se ajustó con precisión para cada tiempo de retardo para garantizar que la posición del punto láser coincidiera con la posición de la gota de muestra en el tiempo de retardo seleccionado. En los XFEL, se aplicó una intensidad de luz de 120 ± 10 mJ por cm2 ya que se encontró que la evolución de O2 estaba saturada a 70 mJ por cm2 para las dimensiones y concentraciones de las muestras utilizadas en nuestros experimentos4. Una intensidad de luz de 120 mJ por cm2 corresponde a aproximadamente 140 fotones absorbidos por monómero PS II en la capa frontal de 5 µm del cristal y aproximadamente 9 fotones por monómero PS II cuando se asume un espesor de cristal de 60 µm (que es el límite de tamaño superior de los cristales utilizados en este estudio) para la capa posterior de 5 µm. Esta densidad de fotones asegura la saturación en todo el volumen del cristal, incluso en el caso de dos cristales apilados uno encima del otro en el rayo láser. Dada una longitud de pulso mínima de 5 ns y 35 Chl por monómero PS II, la intensidad de la luz utilizada promedia 0,8 fotones por (Chl y nanosegundo) para el frente y 0,05 fotones por (Chl y nanosegundo) para la parte posterior del cristal. Si un centro PS II está experimentando una separación de carga, los fotones adicionales absorbidos por la antena interna Chl se disipan rápidamente en forma de fluorescencia con una vida útil promedio de fluorescencia de alrededor de 0,5 a 1 ns, lo que evita cualquier sobreexcitación del centro de reacción o provoca cualquier calentamiento. artefactos

Los datos de cristalografía se recopilaron en varias instalaciones y los detalles se enumeran en la Tabla complementaria 2. También se tabulan las condiciones del haz experimental y las configuraciones del detector utilizadas para recopilar cada conjunto de datos. La muestra se entregó en la región de interacción de rayos X utilizando la configuración Drop-on-Tape descrita anteriormente55. Las condiciones de iluminación para poblar diferentes estados S se detallan en la ref. 4.

Los datos recolectados para los diferentes estados de iluminación fueron procesados ​​usando el programa dials.stills_process con una celda unitaria objetivo de a = 117.0 Å, b = 221.0 Å, c = 309.0 Å, α = β = γ = 90° y el grupo espacial P212121 . Los puntos de Bragg se integraron en el borde del detector. Se aplicó una corrección de absorción Kapton debida a la cinta transportadora de nuestro sistema de entrega de muestras a cada punto de Bragg integrado, teniendo en cuenta el tamaño de gota, el grosor de la cinta, el ángulo de la cinta y la posición de los puntos de difracción en el detector con respecto a la posición del cristal. . Antes de la integración, también realizamos el refinamiento del conjunto de los parámetros del cristal y del detector utilizando el programa cctbx.xfel.stripe_experiment, que ha demostrado reducir la distribución de celdas unitarias y mejorar los mapas finales de diferencias isomorfas56. Finalmente, las intensidades se fusionaron usando el programa cctbx.xfel.merge, que aplica un corte de resolución por imagen y filtrado de las redes usando un umbral de celda unitaria del 1% del modelo de referencia. Para fusionar las reflexiones, utilizamos las mejores prácticas descritas en la ref. 57. Las celdas unitarias y el número de retículas combinadas para cada conjunto de datos se tabulan en las Tablas de datos ampliados 1 y 2.

Los conjuntos de datos combinados finales se adquirieron para 2F, 3F (50 µs), 3F (250 µs), 3F (500 µs), 3F (730 µs), 3F (1200 µs), 3F (2000 µs), 3F (4000 µs) y estados 3F (200 ms) a resoluciones entre 2,16 y 2,0 Å, obtenidos al fusionar entre 6.659 y 39.199 redes (Tablas de datos ampliados 1 y 2). Los conjuntos de datos combinados finales antes de la construcción del modelo también se escalaron en función de la ubicación de cada resolución a un conjunto de datos de referencia (en este caso, el conjunto de datos de referencia es el conjunto de datos PS II publicado en el código de ID de PDB 7RF1)12. Esto nos permite realizar una comparación más precisa de mFobs − DFcalc omitir mapas y 2mFobs − DFcalc mapas entre diferentes conjuntos de datos.

Cada conjunto de datos se refinó utilizando una estructura PS II de alta resolución (1,89 Å) que se publicó en un trabajo anterior (código de ID de PDB 7RF1)12 como punto de partida utilizando el programa phenix.refine58. El refinamiento se realiza en varias etapas. Primero, los factores B del modelo inicial se establecen en 30 y se eliminan todas las aguas y los átomos del OEC. Se realizó un refinamiento inicial del cuerpo rígido junto con el refinamiento de las coordenadas xyz y los factores B isotrópicos durante 15 ciclos para ajustar el modelo a la celda unitaria. A continuación, los átomos de OEC se vuelven a agregar y se refinan con restricciones de enlace personalizadas durante varios ciclos. También utilizamos restricciones de unión personalizadas para la clorofila-a (para permitir la colocación correcta del Mg en relación con el plano del anillo de porfirina) y ligandos similares a lípidos desconocidos (ácido estérico) en el refinamiento. Después del refinamiento inicial del complejo de proteína OEC +, se agregaron aguas al modelo utilizando el protocolo de recolección de agua phenix.refine, así como la colocación manual de aguas a través de coot59 y realizando múltiples ciclos de refinamiento.

En esta etapa, dividimos el modelo en la vecindad del OEC y el propio OEC (solo átomos de proteína y OEC) en múltiples componentes (Tabla 3 de datos extendidos). La división se realizó solo en partes de las cadenas A/a, C/c y D/d. La justificación y la población de los componentes en cada punto de tiempo utilizado se describen en la sección Estimación de la distribución de la población en cada punto de tiempo. En cada conjunto de datos, el confórmero principal (definido como el intermedio que avanza de S3 a S0) se refina utilizando una estrategia de refinamiento recíproco xyz + factor B isotrópico. Para los componentes secundarios/terciarios (cuyas estructuras se conocen porque están en el estado S3 o S0), solo se ajustan los factores del grupo B (estrategia group_adp en phenix.refine) para ajustarlos a la resolución del conjunto de datos. Para la parte restante del modelo que no se divide, el refinamiento xyz recíproco regular y el refinamiento del factor B isotrópico se realizan en tándem para ciclos múltiples. Todas las aguas (excepto las aguas terminales ligadas al OEC; es decir, W1–W4) se refinaron como un solo componente.

El refinamiento de la OEC en el componente principal del modelo multicomponente se realizó utilizando restricciones personalizadas que se usaron para modelar el estado S3. Sin embargo, para todos los puntos de tiempo, usamos valores de sd estimados ligeramente más flexibles para las restricciones (0.1 Å para enlaces, 10° para ángulos) para permitir que los átomos OEC durante el refinamiento se muevan hacia donde la densidad de electrones se modela de manera óptima y reduzca la tensión en el refinamiento manteniendo al mismo tiempo la forma general del racimo. El OEC en el estado S0 se modeló con restricciones utilizadas para nuestra estructura de estado S0 publicada anteriormente. Las restricciones utilizadas para modelar los átomos OEC en los puntos de tiempo se han proporcionado como archivos de texto (esquemas 1–3 en Datos complementarios).

La distribución de la población del estado S en la transición S3→S0 es una distribución heterogénea que consta de (1) centros que avanzan desde el estado S3 al estado S0, (2) centros que se retrasan en una transición y, por lo tanto, avanzan desde el estado Estado S2 a S3 y (3) centros que han hecho la transición al estado S0. Mientras que la mayoría de los centros están en la categoría (1), debido a las ineficiencias intrínsecas ('misses') del ciclo de Kok en PS II20, una cierta fracción de centros está en la categoría (2). Además, después de cierto tiempo en la transición S3-S0, un número sustancial de centros habrán formado el estado S0 estable (categoría (3)).

Dado este contexto, es importante tener en cuenta esta heterogeneidad de la población en nuestro modelo estructural para obtener mapas y modelos de densidad de electrones precisos. Hacemos esto dividiendo nuestro modelo estructural cerca de la región del sitio activo (incluido el OEC) en múltiples componentes. El componente principal de cada conjunto de datos es la categoría (1), que es la transición intermedia de S3 a S0. La naturaleza de los componentes secundarios y terciarios depende del conjunto de datos en consideración. En cada conjunto de datos, se refinan las coordenadas/factores B isotrópicos de solo el componente primario (categoría (1)). Las estructuras de los componentes secundarios y terciarios se modelan a partir de estructuras conocidas o depositadas previamente y solo se ajustan para la resolución utilizando un refinamiento del factor B del grupo. La identidad del componente secundario (y terciario si se usa) depende del punto de tiempo que se esté procesando. Por ejemplo, en el conjunto de datos 3F(50 µs), se construye un modelo de dos componentes con las coordenadas/factores B del modelo 2F(50 µs) que se utilizan para el componente secundario. En los datos de 3F (1200 µs), usamos un modelo de tres componentes con los componentes secundario y terciario en los estados S0 y S3. Las poblaciones para cada uno de los componentes en los diversos puntos de tiempo se dan en la Tabla 3 de datos ampliados. Usamos números disponibles en la literatura para realizar un análisis cinético que arrojó una estimación de la distribución de la población. Dado que las poblaciones por debajo del 10 % se encuentran en el nivel de ruido para el refinamiento estructural, ajustamos nuestras poblaciones para evitar conformarse con poblaciones tan bajas.

La distribución de la población en cada uno de los estados S metaestables se ha determinado previamente mediante la técnica MIMS. En nuestro trabajo, el estado 2F inicial, que se genera al iluminar con dos láseres visibles con un intervalo de destello de 200 ms, consta de aproximadamente un 65 % de estado S3 y un 35 % de estado S2 según estudios realizados en cristales. Con el tercer destello visible, se inicia la transición S3→S0. Se remite al lector a los datos ampliados en la ref. 4 para obtener más detalles sobre cómo se estimaron las poblaciones de estado S para cada uno de los estados de flash, teniendo en cuenta los parámetros de falla calculados a partir de datos XES y MIMS, y la iluminación cruzada (esto fue insignificante a la velocidad de la cinta y la frecuencia de deposición de la gota acústica). eyección que se utilizó en el presente estudio). Todos los resultados descritos en este documento son del monómero I (cadenas anotadas en mayúsculas en las estructuras publicadas). Se observan tendencias similares para el monómero II (cadenas anotadas en minúsculas).

La distancia Mn1–Mn4 permanece alargada hasta 3F(1,200 µs) en el intermedio que experimenta la transición S3→S0, luego de lo cual se observa una disminución en los siguientes 3 ms. Probamos la solidez de la distancia alargada a 3F (1200 µs) mediante la construcción de una hipótesis alternativa para explicar esta observación, postulando que podría deberse a dos poblaciones separadas en el componente primario: (1) aumento de la distancia Mn1–Mn4 debido a fallas que forman S3 adicional o (2) distancia reducida Mn1–Mn4 (con/sin desaparición de Ox) que es una propiedad del intermedio que experimenta la transición S3→S0. Modelamos este escenario aumentando la población S3 del 35 al 55 % y disminuyendo el componente primario (con/sin Ox) del 40 al 20 % en el punto de tiempo 3F (1200 µs). El refinamiento resultante dio distancias Mn1-Mn4 de 5,14 Å (con Ox) y 5,09 Å (sin Ox). Ambos números son similares a la distancia dada en la Fig. 3 y dentro del error de medición. Por lo tanto, las pruebas no muestran contracción en comparación con el estado S3 y nos permiten rechazar la hipótesis. Reiteramos que la estimación de la población S3 del 35 % en el punto de tiempo 3F (1200 µs) está bien establecida utilizando varios experimentos independientes, como se detalla en la sección anterior y en publicaciones anteriores.

Para estimar la precisión posicional de los átomos de OEC y los aminoácidos circundantes para cada punto de tiempo, usamos el procedimiento END/RAPID60, similar al que se empleó anteriormente6. Brevemente, en este método, perturbamos los factores de estructura en una cantidad aleatoria entre ±(mFobs − DFcalc). Las coordenadas atómicas del modelo final para ese punto de tiempo también se perturban en una pequeña cantidad para permitir que el modelo explore un mayor espacio de fase (solo se perturba el confórmero primario). Posteriormente, se generan 100 conjuntos de datos sintéticos de este tipo para cada punto de tiempo, y luego cada uno se refina por separado. A partir del conjunto de estos conjuntos de datos refinados, podemos estimar el error asociado con la métrica de distancia de interés. Los errores obtenidos deben considerarse un límite superior ya que las perturbaciones introducidas en los factores de estructura son una sobreestimación de los errores reales en el experimento.

Los detalles de implementación se pueden encontrar en https://bl831.als.lbl.gov/END/RAPID/end.rapid/Documentation/end.rapid.Manual.htm.

Todos los mapas de omisión de mFobs − DFcalc que se muestran en el manuscrito se generaron utilizando el programa phenix.polder y utilizando los coeficientes de mapa de omisión normales del archivo output.mtz (no los coeficientes de mapa de polder)61. Para el cálculo de la altura máxima donde se indique, utilizamos secuencias de comandos de Python personalizadas que promedian los mFobs - DFcalc omite el valor del mapa en un radio de 0,5 Å del átomo de interés.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Las coordenadas atómicas y los factores de estructura se han depositado en Protein Data Bank, www.pdb.org (códigos PDB 8EZ5 para los datos 2F; 8F4D para los datos 3F (50 μs); 8F4E para los datos 3F (250 μs); 8F4F para los datos 3F (500 μs); 8F4G para los datos 3F (730 μs); 8F4H para los datos 3F (1200 μs); 8F4I para los datos 3F (2000 μs); 8F4J para los datos 3F (4000 μs); 8F4K para los datos 3F (200 ms) y 8F4C para los datos alternativos 2F). Los datos del láser de electrones libres de rayos X sin procesar se han depositado en la base de datos de imágenes de rayos X de Coherent, www.cxidb.org (ID 215).

Los programas de código abierto dials.stills_process, cctbx.xfel GUI, cctbx.xfel.stripe_experiment, cctbx.xfel.merge y el programa heredado cxi.merge se distribuyen con paquetes DIALS disponibles en http://dials.github.io. Las instrucciones y los detalles para usar estos programas se pueden encontrar en las refs. 56,57 con más documentación disponible en http://cci.lbl.gov/xfel. Las figuras que se muestran en el documento se representaron utilizando el software PyMOL v.2.5 (ref. 62). El código personalizado utilizado para calcular los valores de altura máxima está disponible públicamente en https://github.com/asmit3/eden (ref. 63).

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Agradecemos a K. Sauer (1931–2022) por su interés en esta investigación y por muchas discusiones sobre la oxidación fotosintética del agua. Agradecemos a R. Massad, M. Kretzschmar, P. Sinnott, J. Blaschke, A. Britz, S. Carbajo, C. de Lichtenberg, L.-C. Kao, L. Lassalle, D. Liebschner, D. Mendez, F. Moss, E. Pastor, C. Pham, B. Poon, KD Sutherlin e ID Young por su apoyo durante la preparación de muestras, la recopilación y el procesamiento de datos. Agradecemos al personal de apoyo de LCLS/SLAC, SACLA/Japón, SSRL y ALS. Este trabajo fue apoyado por el Director, Office of Science, Office of Basic Energy Sciences (OBES), División de Ciencias Químicas, Geociencias y Biociencias del Departamento de Energía (DOE) (JY, VKY y JK) para espectroscopia de rayos X. y la recopilación y el análisis de datos de cristalografía, y el desarrollo de métodos para sistemas fotosintéticos fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud (NIH; subvenciones GM055302 (VKY) para bioquímica del fotosistema II, GM110501 (JY) y GM126289 (JK) para desarrollo de instrumentación para rayos X experimentos con láser de electrones libres (XFEL) y GM117126 (NKS) para el desarrollo de protocolos computacionales para datos XFEL). NKS reconoce el apoyo del Proyecto de Computación Exascale (subvención 17-SC20-SC), un esfuerzo de colaboración de la Oficina de Ciencias del DOE y la Administración Nacional de Seguridad Nuclear. Estrategia de Excelencia de Alemania (proyecto EXC 2008/1-390540038 (AZ, HD y SH)) coordinado por TU Berlin y la Fundación Alemana de Investigación a través del Centro de Investigación Colaborativa SFB1078 (Humboldt Universität zu Berlin), TP A5 (AZ, HD, MI, RH y JG) y Vetenskapsrådet (subvenciones 2016-05183 (JM) y 2020-03809 (JM)) así como a Energimyndigheten (subvención 45421-1 (JM)) por su apoyo. RH reconoce el apoyo de Caroline von Humboldt Stipendium, Humboldt Universität zu Berlin. CJK reconoce el apoyo del NIH (premio de beca NRSA F32GM142218). Esta investigación utilizó recursos de NERSC, una instalación de usuario respaldada por la Oficina de Ciencias, DOE (contrato DE-AC02-05CH11231). Los datos XFEL se recopilaron en LCLS/SLAC, Stanford y SACLA, Japón. Los experimentos XFEL en SACLA se realizaron en BL2 con la aprobación del Instituto de Investigación de Radiación Sincrotrón de Japón (propuestas 2018B8089, 2019A8081 y 2019B8067). Las pruebas de cristales y varias partes de la configuración se llevaron a cabo en instalaciones de sincrotrón proporcionadas por ALS en Berkeley y SSRL en Stanford, financiadas por DOE OBES. El Programa de Biología Molecular Estructural SSRL cuenta con el apoyo del DOE OBER y los NIH (subvención P41GM103393). El uso de LCLS y SSRL, SLAC National Accelerator Laboratory cuenta con el apoyo del DOE, Office of Science, OBES (contrato DE-AC02-76SF00515) y el trabajo de biología estructural en el LCLS cuenta con el apoyo de los NIH (subvención P41GM139687; el detector Rayonix fue financiado por la subvención S10 OD023453).

Mohamed Ibrahim

Dirección actual: Instituto de Medicina Molecular, Universidad de Lübeck, Lübeck, Alemania

Estos autores contribuyeron igualmente: Asmit Bhowmick, Rana Hussein, Isabel Bogacz, Philipp S. Simon

División de Biofísica Molecular y Bioimagen Integrada, Laboratorio Nacional Lawrence Berkeley, Berkeley, CA, EE. UU.

Asmit Bhowmick, Isabel Bogacz, Philipp S. Simon, Ruchira Chatterjee, Margaret D. Doyle, In-Sik Kim, Hiroki Makita, Medhanjali Dasgupta, Corey J. Kaminsky, Miao Zhang, Isabela I. Nangca, Stephen M. Keable, James M. .Holton, Daniel W. Paley, Nigel W. Moriarty, Paul D. Adams, Aaron S. Brewster, Nicholas K. Sauter, Jan Kern, Junko Yano y Vittal K. Yachandra

Departamento de Biología, Universidad Humboldt de Berlín, Berlín, Alemania

Rana Hussein, Mohamed Ibrahim, Julia Gätcke, Stephanie Haupt, Holger Dobbek y Athina Zouni

Biomimética Molecular, Departamento de Química — Ångström, Universidad de Uppsala, Uppsala, Suecia

Mun Hon Cheah, Petko Chernev, A. Orkun Aydin, Fikret Mamedov y Johannes Messinger

Departamento de Química Teórica y Biología, KTH Royal Institute of Technology, Estocolmo, Suecia

Tomás Fransson

Instituto de Investigación de Radiación Sincrotrón de Japón, Hyogo, Japón

Kensuke Tono y Shigeki Owada

Centro RIKEN SPring-8, Hyogo, Japón

Kensuke Tono y Shigeki Owada

Fuente de luz coherente Linac, SLAC National Accelerator Laboratory, Menlo Park, CA, EE. UU.

Leland B. Gee, Franklin D. Fuller, Alexander Batyuk y Roberto Alonso-Mori

Departamento de Bioquímica y Biofísica, Universidad de California, San Francisco, CA, EE. UU.

James M Holton

SSRL, Laboratorio Nacional de Aceleradores SLAC, Menlo Park, CA, EE. UU.

James M Holton

Departamento de Bioingeniería, Universidad de California, Berkeley, CA, EE. UU.

Pablo D Adams

Departamento de Física, Universidad de Wisconsin–Madison, Madison, WI, EE. UU.

Uwe Bergmann

Departamento de Química, Universidad de Umeå, Umeå, Suecia

johannes messinger

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RA-.M., NKS, UB, AZ, JM, JK, JY y VKY diseñaron el experimento. Muestras preparadas por RH, MI, RC, MD, MZ, JG, SH, IIN, AZ y JK. RC, MHC, TF, JG, SH, AOA y FM caracterizaron la actividad de la muestra. KT, SO, LBG, FDF, A.Batyuk y RA-.M. preparó y operó las líneas de haz del láser de electrones libres de rayos X (XFEL). IB, PSS, PC, I.-SK, HM, FDF y JK desarrollaron, probaron y ejecutaron el sistema de entrega de muestras. A.Bhowmick, RH, IB, PSS, MI, RC, MDD, MHC, TF, PC, I.-SK, HM, MD, CJK, MZ, JG, SH, SMK, KT, SO, LBG, FDF, A .Batyuk, RA-.M., DWP, ASB, NKS, UB, AZ, JM, JK, JY y VKY realizaron el experimento XFEL. A.Bhowmick, JMH, DWP, NWM, PDA, ASB y NKS desarrollaron un nuevo software para el procesamiento de datos. A.Bhowmick, MD, SMK, DWP, ASB y NKS procesaron datos XFEL. A.Bhowmick, RH, IB, PSS, MI, MDD, HD, NKS, AZ, JM, JK, JY y VKY analizaron e interpretaron los datos. A.Bhowmick, RH, IB, PSS, MDD, AZ, JM, JK, VKY y JY escribieron el manuscrito con aportes de todos los autores.

Correspondencia a Athina Zouni, Johannes Messinger, Junko Yano o Vittal K. Yachandra.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature agradece a Richard Neutze, Dimitrios Pantazis y los demás revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Para comparar el nivel de altura del pico, también se muestra el mapa de omisión del átomo de oxígeno, O2. Los mapas de omisión para cada átomo se generaron omitiendo individualmente el átomo solo en el confórmero primario en cada conjunto de datos. Los mapas se muestran en niveles de contorno de 2,5, 3 y 4σ. (a) Omita los mapas de OX, O5 y O2 (b) Omita los mapas de W1, W2, W3, W4 y O2. Se observa una clara reducción en la altura del pico del mapa de omisión de OX, O5, W1, W2, W3, W4 con respecto al mapa de omisión de O2 de referencia entre 730 y 2000 µs.

El mapa se muestra en un nivel de contorno de 2,5σ (en amarillo). La densidad de electrones se observa en este nivel entre W3 y W4 (ver flecha roja), lo que posiblemente indica un movimiento de agua transitorio que también fue corroborado por la superposición de las densidades del mapa omitido. A modo de comparación, los mapas de omisión individuales de W3 y W4 también se superponen en 2,5, 3 y 4σ (esquema de colores igual que en la Fig. 2 en el texto principal). También se observa una densidad de electrones más fuerte alrededor de W1/D61 posiblemente relacionada con el movimiento que involucra una transferencia de protones como se analiza en el texto principal relacionado con la Fig. 2. La densidad de electrones alrededor de O1 posiblemente esté relacionada con los cambios observados en W26-W30 (denominados como la región de la 'rueda de agua') en este punto de tiempo (discutido en el texto principal relacionado con la Fig. 4).

La distribución del factor B de todas las aguas del canal se superpone para cada punto de tiempo para la comparación. Los valores del eje y de los puntos marcadores para las 4 aguas son solo marcadores de posición. Hay un cambio marcado en los valores relativos del factor B de W27, W28 y W32 en el punto de tiempo 3F (1200 µs) que coincide con la desaparición de OX.

Cuadros complementarios 1 y 2.

Esta carpeta comprimida contiene los Esquemas complementarios 1–3: Restricciones utilizadas para modelar el OEC en la transición S3→S0.

Vídeo que muestra los distintos cambios en la OEC en la transición S3→S0. Versión de alta resolución disponible en: https://drive.google.com/file/d/1d4fMKBcYUdenqajlXo3J-a8lU5eaUxe3/view?usp=share_link.

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Reimpresiones y permisos

Bhowmick, A., Hussein, R., Bogacz, I. et al. Evidencia estructural de intermediarios durante la formación de O2 en el fotosistema II. Naturaleza 617, 629–636 (2023). https://doi.org/10.1038/s41586-023-06038-z

Descargar cita

Recibido: 18 noviembre 2022

Aceptado: 31 de marzo de 2023

Publicado: 03 mayo 2023

Fecha de emisión: 18 de mayo de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41586-023-06038-z

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